AVIDIN

AVIDIN, PROTEIN PENGIKAT BIOTIN

ABSTRAK

Pengetahuan mengenai protein telah berkembang dengan pesat, dan diaplikasikan dalam bioteknologi. Melalui pemahaman mengenai konsep protein, peneliti mampu memecahkan masalah dan memberikan solusi agar kehidupan manusia menjadi lebih baik, misalnya penyelesaian masalah kesehatan, pangan, obat-obatan sampai pembasmian hama tanaman. Avidin adalah salah satu protein yang mempunyai arti penting dalam bioteknologi.
Avidin merupakan molekul glikoprotein. Avidin alami berasal dari putih telur ayam. Avidin dapat mengikat empat molekul biotin baik yang bebas maupun terikat dengan enzim. Interaksi avidin/streptavidin merupakan interaksi biologis nonkovalen terkuat yang diketahui di antara protein dan ligan. Interaksi avidin-biotin atau streptavidin-biotin ideal sebagai suatu sistem penghubung yang umum dalam berbagai aplikasi, terutama dalam bioteknologi.
Interaksi avidin biotin untuk dimanfaatkan secara luas dalam tes biokimia, dan imuno histokimia, termasuk western blot dan ELISA. Avidin juga digunakan sebagai media pemurnian untuk menangkap protein berlabel biotin atau molekul asam nukleat. Interaksi avidin dan biotin digunakan pada radioterapi untuk meningkatkan efektifitas pengobatan dan mengurangi efek samping radioterapi. Interaksi Avidin-biotin juga digunakan dalam teknologi pertanian sebagai insektisida. Avidin berperan dalam siklus sel, sehingga berpotensi sebagai antiproliferasi sel yang akan dikembangkan sebagai antikanker.

Kata kunci : avidin-biotin kompleks, streptavidin.

Pendahuluan.
Ilmu yang bermanfaat adalah ilmu diikuti dengan penerapannya dalam kehidupan. Ilmu tersebut dikembangkan dengan metode ilmiah dan diterapkan dalam bentuk teknologi. Hal ini terjadi juga pada protein. Pengetahuan mengenai protein telah berkembang dengan pesat, dan diterapkan dalam bentuk bioteknologi. Melalui pemahaman mengenai konsep protein, peneliti mampu memecahkan masalah dan memberikan solusi agar kehidupan manusia menjadi lebih baik, misalnya penyelesaian masalah kesehatan, pangan, obat-obatan sampai pembasmian hama tanaman.
Protein adalah biomakromolekul yang melaksanakan hampir seluruh fungsi kehidupan. Protein adalah polimer yang cukup besar sebagai molekul pendukung. Protein dapat berubah-ubah struktur tiga dimensinya sesuai fungsinya. Dan, protein dapat mengelola dan memanfaatkan sumber energi dalam berbagai bentuk. Dalam menjalankan fungsinya, kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut. Avidin adalah salah satu protein yang memiliki arti penting dalam bioteknologi.
Avidin merupakan glikoprotein yang dikenal secara luas dapat mengikat biotin. Avidin dapat mengikat empat molekul biotin baik yang bebas maupun terikat dengan enzim. Interaksi avidin/streptavidin merupakan interaksi biologis nonkovalen terkuat yang diketahui di antara protein dan ligan. Sifat dasar inilah yang menjadi ide pokok, dikembangkan, dan diaplikasikan dalam bioteknologi, misalnya digunakan dalam teknik berbagai pemeriksaan laboratorium, pengobatan, dan teknologi pertanian.
Tulisan ini berupaya untuk memberikan pemahaman bahwa dasar ilmu biomedik dapat kembangkan dan diaplikasikan dalam bioteknologi, sehingga memberikan manfaat yang luas bagi umat manusia.

Penemuan avidin.
Avidin ditemukan oleh Esmond Emerson Snell pada tahun 1940. Penemuan dimulai dengan penelitian pendahuluan yang menunjukkan, bahwa, anak ayam dengan diet putih telur mentah mengalami gejala kekurangan biotin, suatu anggota kelompok vitamin B yang berfungsi sangat penting dalam metabolisme sebagai koenzim dari reaksi karboksilasi. Gejala kekurangan biotin tersebut tetap ada meskipun diberikan vitamin dalam diet anak ayam tersebut. Fenomena ini mengindikasikan bahwa ada komponen dari putih telur yang mengikat biotin. Untuk melihat apakah interaksi ini dapat direplikasi secara invitro, Snell menambahkan albumin telur ke larutan biotin streril, lalu, menguji aktifitas biotin tersebut menggunakan uji ragi yang dikembangkannya. Snell kemudian mengisolasi komponen putih telur mentah yang mengikat biotin, dan, dia menemukan bahwa zat tersebut dapat di pisahkan dari biotin dengan pemanasan tapi tidak dengan dialisis atau perubahan pH. Selanjutnya Snell bekerja sama dengan Paul Gyorgy, menegaskan bahwa protein putih telur yang diisolasi adalah penyebab defisiensi biotin atau ” egg white injury ” pada percobaan menggunakan tikus. Pada saat itu, protein yang ditemukan sementara dinamakan avidalbumin (harfiah, albumin lapar) oleh peneliti di University of Texas. Nama protein itu kemudian direvisi menjadi” avidin “berdasarkan pada afinitas untuk biotin (avid + biotin).1

Isolasi dan purifikasi avidin
Banyak cara yang digunakan untuk memurnikan avidin mulai dari yang sederhana sampai metode mutakhir. Snell menggunakan prosedur presipitasi aseton dengan ekstraksi garam untuk pemurnian avidin dari putih telur ayam.1 Namun pada metode ini kadang avidin masih bercampur dengan lisozim. Metode terbaru untuk pemurnian avidin adalah gradiflow. Gradiflow adalah alat elektroforesis preparatif, yang memisahkan protein berdasarkan muatan atau ukuran, digunakan untuk memurnikan avidin, pI 10, dari putih telur ayam. Metode ini menggunakan pemisahan berbasis muatan pada pH 9.0, pI tinggi avidin dan lisozim (pl 10.7) memungkinkan mereka untuk dapat dengan mudah dipisahkan dari protein putih telur yang tersisa, karena hanya dua protein ini yang bermuatan positif. Dalam langkah kedua pada pH 10.2, avidin menjadi bermuatan negatif dipisahkan dari lisozim yang bermuatan positif. Dua langkah berurutan protokol ini selesai dalam 4,5 jam. Immunoassay enzim fraksi avidin yang diperoleh dari metode ini menunjukkan pemurnian dari 60-65% dari satu putih telur dengan aktivitas lisozim terditeksi minimal.2
Karakteristik fisikokimia avidin
Avidin merupakan molekul glikoprotein. Berat molekul avidin adalah 67.000 dalton. Avidin bermuatan positif dengan titik isoelektrik pada pH 10,5.Avidin adalah protein tetramerik, mengandung empat subunit identik (homotetramer) yang terbentuk dari empat subunit yang menyatu. Dalam semua struktur kristal, keempat subunit avidin menampilkan hampir tepat 222 simetri. Setiap rantai avidin (128 asam amino) disusun dalam untai delapan antiparalel beta-barel, yang bagian dalamnya mendefinisikan situs mengikat D-biotin. Dasar molekul afinitas D-biotin dapat dikenali pada situs pengikatan yang cukup kaku dan sterik melengkapi bentuk dan polaritas vitamin yang masuk, dan mudah diakses dalam struktur apoprotein.3 Sekitar 10% dari berat molekul avidin adalah karbohidrat yang terdiri dari 4-5 mannose dan tiga residu N-asetilglukosamin. Gugus karbohidrat dari avidin mengandung sedikitnya tiga jenis oligosakarida dengan struktur unik yang mirip dalam struktur dan komposisinya. Muatan positif avidin dan kandungan karbohidratnya inilah yang dapat membuat avidin berikatan secara nonspesifik dengan permukaan sel atau DNA yang bermuatan negatif. Empat subunit identik avidin, masing-masing dapat mengikat biotin baik yang bebas maupun terikat dengan enzim dengan tingkat afinitas dan spesifisitas yang tinggi. Ikatan non kovalen terbentuk oleh biotin yang berikatan dengan asam amino triptofan dalam subunit tersebut.3
Ada dua jenis asam amino yang berperan dalam interaksi avidin-biotin yaitu triptofan dan lisin. Green membuktikan dengan Biotininduced perbedaan spektrum dan studi modifikasi kimia menunjukkan bahwa triptofan berperan penting dalam mengikat biotin. Kelompok fungsional lainnya yang telah secara langsung terlibat dalam situs pengikatan avidin adalah gugus amino. Dalam hal ini, Green mengamati bahwa laju awal reaksi 1 -fluoro-2,4-dinitrobenzene dengan avidin lebih cepat dibandingkan dengan kompleks avidin-biotin. Jika reaksi dihentikan setelah rata-rata satu grup 2,4-dinitrofenil (DNP) diintroduksikan per subunit, hampir tidak ada aktivitas biotin-binding yang tersisa. Hal ini menunjukkan keterlibatan residu lisin dalam situs aktif. Lokasi yang tepat dari residu lisin ini tidak ditentukan. Berbeda dengan interaksi 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene dengan avidin, baik asam 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic dan dansil klorida bereaksi dengan avidin tanpa kehilangan aktivitas biotin-binding.4
Struktur avidin tetap stabil pada suhu di bawah 70°C. Di atas 70°C, struktur avidin cepat terganggu dan 85°C, ditemukan kehilangan struktur yang luas dan kemampuan untuk mengikat biotin. Sebuah penelitian pada tahun 1991 yang dipublikasikan pada Journal of Food Science, meneliti aktivitas avidin substansial dalam putih telur yang dimasak. Aktivitas avidin masih bersisa dalam putih telur yang digoreng dan direbus selama 2 menit sebesar 33% dan 40% dari aktivitas di putih telur mentah. Memasak telur dalam waktu yang singkat, tidak cukup untuk memadai untuk memanaskan semua area tempat dingin dalam putih telur. Inaktivasi lengkap kapasitas pengikatan biotin avidin memerlukan keadaan mendidih selama lebih dari 4 menit.5
Avidin masih dapat di pecahkan menjadi fragmen yang fungsional. Karena stabilitas avidin yang ekstrim untuk hidrolisis enzimatik, fragmen avidin hanya dapat dipecah dengan cara kimia. Perlakuan avidin dengan hidroksilamin terbukti menghasilkan situs pembelahan baru selain dikenal situs belahan Asn-Gly (posisi 88-89 di avidin), ikatan peptida Asn-Glu dan Asp-Lys (posisi 42-43 dan 57-58) yang mudah dibelah; di samping itu, tingkat yang lebih rendah dari hidrolisis Gln-Pro (61-62) dan Asn-Asp (12-13 dan 104-105) obligasi bisa dideteksi. Peptida fragmen pengikat biotin terkecil, berasal dari pembelahan hydrosilamin baik dari avidin asli atau avidin non-glikosilasi, diidentifikasi untuk terdiri residu 1-42. Belahan CNBr belahan menghasilkan fragmen 78-asam amino residu (residu 19-96) yang masih memperpertahankan aktivitas avidin. Fungsi penting pengikat biotin ada di wilayah yang tumpang tindih (residu 19-42) dari avidin, bagian yang menyandang tirosin tunggal. 6
Sumber dan fungsi biologis avidin.
Avidin diproduksi oleh sel goblet di dalam oviduk unggas. Dalam saluran reproduksi vertebrata bertelur, avidin telah berkembang menjadi protein sekretori tergantung progestin yang terlibat dalam aksi antimikroba melalui proses pengikatan biotin. Adanya avidin membatasi pertumbuhan bakteri pengganggu di oviduk. Avidin akan terakumulasi pada putih telur unggas. Sebutir telur ayam mengandung sekitar 0,05% (sekitar 1,8 mg) avidin. Selain pada unggas, avidin juga ditemukan pada telur amfibi dan reptil.7 Pada fase akut radang, avidin juga disintesis dan disekresi oleh berbagai jaringan yang terluka dalam unggas domestik jantan maupun betina, spesies unggas lainnya dan kadal. Produksi avidin non-oviductal pada unggas domestik memiliki berbagai macam induser, misalnya peradangan akut jaringan yang disebabkan oleh cedera mekanik atau termal, infeksi bakteri septik dan racun, dan transformasi sel retrovirus-induced. Banyak jenis sel seperti makrofag, heterophils dan fibroblas dapat menghasilkan avidin setelah cedera seluler non-spesifik. Dalam kultur, fibroblas embrio ayam dan makrofag yolk sac juga mensintesis dan mensekresi avidin. 8
Avidin tidak ditemukan secara alami pada manusia. Serum manusia mengandung antibodi alami untuk avidin. Dari 270 sampel yang diuji, semua yang mengandung antibodi dengan kadar berbeda, terutama dari IgG dan IgM.9
Avidin dapat pula diproduksi dari tanaman transgenik. Sejak tahun 1997, peneliti di amerika serikat berhasil memproduksi avidin dalam bulir jagung transgenik. Karakterisasi fisik avidin yang dimurnikan dari jagung transgenik menunjukkan bahwa karakteristik mengikat urutan asam amino N-terminal dan biotin yang identik dengan protein asli, dan berat molekul hampir identik. Studi ini menunjukkan bahwa memproduksi avidin dari jagung tidak hanya mungkin, namun juga memiliki keuntungan praktis.10
Ada beberapa sumber protein mirip avidin. Bakteri Streptomyces avidii mampu menghasilkan molekul yang memiliki kemampuan yang sama dengan avidin, molekul ini diberi nama streptavidin. Molekul tersebut menjadikan Streptomyces avidii dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain yang hidup di sekitarnya, terutama bakteri yang membutuhkan biotin untuk pertumbuhannya. Oleh karena itu, Streptomyces sering dikultur untuk menghasilkan antibiotik yang berguna bagi manusia.11 Protein mirip avidin lainnya bersumber dari katak yang disebut dengan xenavidin. Xenavidin diidentifikasi dari urutan basis data Expressed Sequence Tag untuk Xenopus tropicalis dan diproduksi dalam sel serangga menggunakan sistem ekspresi baculovirus. Sifat pengikat biotin xenavidin kurang kuat dibandingkan avidin telur ayam dan streptavidin bakteri.12 Selain itu, protein mirip avidin juga ditemukan pada ikan zebra (Danio rerio), yang disebut zebavidin. Protein ini diekspresikan dalam gonad baik ikan zebra jantan dan betina dan insang ikan jantan, tetapi data menunjukkan bahwa zebavidin tidak penting bagi embrio yang sedang berkembang.13

Streptavidin.
Bentuk lain dari avidin yang sering digunakan adalah streptavidin. Streptavidin adalah protein tetramerik pengikat biotin yang diisolasi dari Streptomyces avidinii. Streptavidin memiliki massa 60.000 Dalton. Avidin dan streptavidin memiliki sedikit homologi asam amino, namun struktur mereka sangat mirip. Seperti avidin, streptavidin diduga berfungsi sebagai antibiotik dan memiliki afinitas yang sangat tinggi untuk biotin (Kd = 10-14 untuk -15M). Disosiasi biotin dari streptavidin 30 kali lebih cepat daripadadisosiasi biotin dari avidin. Tidak seperti avidin, streptavidin tidak memiliki karbohidrat dan memiliki titik isoelektrik asam (pI = 5) yang membuat kelarutan streptavidin lebih rendah dari avidin. Produk streptavidin tersedia secara komersial, misalnya Thermo Scientific Pierce Streptavidin, mungkin merupakan bentuk rekombinan streptavidin dengan massa 53.000 Dalton dan titik isoelektrik mendekati netral (pI = 6,8-7,5). Streptavidin baik murni dan rekombinan lebih mahal untuk diproduksi, hal ini membuat reagen streptavidin lebih mahal daripada reagen uji berbasis avidin.14
Streptavidin mempunyai keunggulan dibandingkan dengan avidin karena reaksi non spesifik streptavidin lebih rendah. Lebih rendahnya reaksi non spesifik streptavidin berhubungan dengan sifatnya yang netral dan tidak mempunyai gugus gula, bandingkan dengan avidin yang bersifat basa (pi = 10.5) dan mempunyai gugus gula (glycoprotein).15
Pemanfaatan streptavidin dalam bidang bioteknologi terutama asai (assay) bioanalitik dan biosensor sangat luas. Secara umum pemakaianya dapat dikelompokkan menjadi dua bagian. Pertama, streptavidin diimobilisasi pada solid support seperti membran, microtiter plate, beads, nano particles dan sebagainya. Kedua, streptavidin dilabel dengan enzim atau fluorokrom lalu digunakan untuk mendeteksi atau mengkuantifikasi senyawa biotinil. Sebagai contoh, untuk mendeteksi atau mengukur konsentrasi komplek atau ikatan antara patogen, antigen atau hormon dengan antibodi biotinil spesifik digunakan steptavidin yang dilabel dengan enzim atau fluorokrom.14
Pada awalnya, streptavidin diproduksi dengan media yang mengandung senyawa kompleks seperti protein. Produksi streptavidin yang tinggi dengan menggunakan media kompleks dapat dihasilkan menggunakan bioreaktor dimana aerasi dan shearing dapat terkontrol.15
Untuk menunjang pengembangan teknologi biosensor terutama teknik diagnosa dan bioassay diperlukan ketersediaan streptavidin dalam kuantitas dan kualitas yang mencukupi. Streptavidin dari sumber komersial tidak ideal karena untuk mengimpornya memakan waktu yang lama dan biaya tinggi. Tarigan dari BBPV Bogor mengembangkan teknik produksi dan purifikasi streptavidin.
Teknik produksi dan purifikasi streptavidin di indonesia salah satunya dikembangkan oleh Tarigan. Streptomyces avidinii mula-mula dipropagasi dalam lempeng agar kemudian sel bakteri dari agar dipindahkan kedalam media cair sintetik (4,4 ml/cm2). Setelah 7 hari diagitasi diatas rotary shaker 200 rpm/min pada suhu ruangan (≈28°C), sel bakteri dipeletkan, supernatan dikonsentrasikan menjadi 1/62 volume awal dengan amonium sulfat saturasi 75%. Setelah didialisis dalam larutan amonium carbonat pH 11, suspensi protein diadsorbsikan kedalam kolom iminobiotin agarose. Protein (streptavidin) yang teradsorbsi dielusi dengan larutan sodium asetat pH 4, eluat dikonsentrasikan dengan ultrafiltrasi dan disuspensikan dalam PBS. Pengukuran aktivitas binding streptavidin dilakukan dengan ELISA kompetitif, kompetisi antara streptavidin dalam sampel yang diukur dengan konjugat HRP-streptavidin memperebutkan biotin (IgG biotinil) yang diimobilisasi pada microtitre plate. ELISA ini mempunyai limit deteksi 0,16 μg/ml streptavidin. Metode produksi dan purifikasi yang dikembangkan dalam penelitian ini menghasilkan 160 μg/ml pada biakan supernatan. Setelah dikonsentrasikan dengan amonium sulfat menghasilkan 4 mg/ml (recovery 69%). Hasil akhir setelah kromatografi afiniti diperoleh streptavidin dengan konsentrasi 10 mg/ml (recovery 19%) dengan kemurnian tinggi (>95%). Streptavidin yang dihasilkan terlihat dalam bentuk streptavidin dimer ketika dianalisis dengan SDS PAGE.16
Neutravidin.
Avidin dan streptavidin memiliki kelebihan dan kekurangan. Keuntungan utama dari avidin adalah biaya produksi yang rendah dan kelarutan yang sangat tinggi, dan kelemahannya adalah pI tinggi dan kecenderungan tinggi untuk interaksi nonspesifik dan mengikat lektin. Streptavidin memiliki kemungkinan menimbulkan ikatan nonspesifik lebih rendah dan pI didekat netral. Namun, streptavidin lebih mahal untuk diproduksi.17 Untuk memecahkan masalah tersebut, avidin dimodifikasi menjadi sebuah protein yang dinamakan neutravidin.
Neutravidin adalah sebuah avidin deglikosilasi dengan modifikasi arginin. Neutravidin menunjukkan titik isoelektrik yang lebih netral (pl) dan tersedia sebagai alternatif untuk avidin asli, setiap kali masalah pengikatan non-spesifik muncul. Avidin deglikosidasi adalah sebuah reagen yang jauh lebih ideal tidak akan memiliki masalah pengikatan nonspesifik, memiliki pI didekat netral dan biaya produksi yang lebih efektif. Neutravidin (60.000 Dalton) memiliki massa lebih kecil dibandingkan dengan avidin (67.000 Dalton) dan tetap mempertahankan afinitas tinggi pengikatan biotin. Proses deglikosilasi dari avidin mengurangi pengikatan lektin ke tingkat tidak terdeteksi dan menurunkan titik isoelektrik (pI = 6.3), secara efektif menghilangkan penyebab utama pengikatan nonspesifik avidin.17

Biotin.
Biotin adalah vitamin yang penting bagi tubuh. Biotin memiliki peranan yang sangat penting dalam reaksi biokimia seperti dalam transfer karbon dioksida dan metabolisme karbohidrat dan lemak. Biotin juga merupakan koenzim di dalam tubuh yang berperan dalam metabolisme untuk menghasilkan energi. Mengkonsumsi putih telur mentah dalam jumlah banyak dapat menyebabkan defisiensi biotin.18 Komplek avidin biotin tidak terhidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan, sehingga biotin tidak terserap dan dikeluarkan bersama tinja. Bila putih telur terdenaturasi oleh panas, komplek biotin terpecah sehingga dapat dicerna. Gejala kekurangan biotin sering dijumpai pada orang yang gemar mengkonsumsi telur mentah atau belum matang sempurna.19 Gejala yang muncul akibat kekurangan biotin adalah rambut rontok, mata merah, dermatitis, depresi, halusinasi, dan kesemutan. Pengolahan telur melalui pemanasan akan merusak avidin sehingga tidak lagi merugikan tubuh19. Sifat kimia biotin menjadikannya stabil dalam berbagai lingkungan.18
Biotin adalah vitamin yang larut dalam air. Biotin mengandung sulfur berbentuk kristal yang panjang seperti jarum putih. Biotin Larut dalam etanol 95% namun, tidak larut dalam lemak atau pelarut lemak. Biotin stabil dalam berbagai kondisi lingkungan, seperti panas, paparan cahaya matahari, dan oksigen. Zat yang dapat merusak biotin adalah asam nitrit, formaldehid, asam keras dan basa keras. Biotin dapat dimodifikasi melalui oksidasi ringan (dengan H2O2) biotin dikonversi menjadi sulfoksida, dengan oksidasi kuat (dengan KM¬nO4) menjadi sulfon dan melalui perantara yang kuat (strong agent) sulfurnya dapat mengambil, yang kemudian akan menjadi desthiobiotin. Biotin juga dapat dikonjugasikan dengan molekul lain sehingga memungkinkan untuk digunakan dalam aplikasi bioteknologi.18
Biotinilasi adalah proses melekatkan biotin secara kovalen dengan protein, asam nukleat atau molekul lainnya. Rantai samping asam valerat dari molekul biotin dapat diderivatisasi untuk menggabungkan berbagai kelompok reaktif yang memfasilitasi penambahan tag biotin dengan molekul lain. Biotinilasi prosesnya cepat, spesifik dan tidak mengganggu fungsi alami molekul karena ukuran biotin kecil (MW = 244,31 g / mol). Biotin mengikat streptavidin dan avidin dengan afinitas yang sangat tinggi, cepat, dan spesifisitas yang tinggi, dan interaksi ini dimanfaatkan dalam berbagai bidang bioteknologi untuk mengisolasi molekul terbiotinilasi.20
Biotin yang terikat streptavidin atau avidin tahan terhadap panas, pH dan proteolisis. Hal ini membuat penangkapan molekul biotin menjadi mungkin dalam berbagai lingkungan. Beberapa molekul biotin dapat terkonjugasi dengan protein, yang memungkinkan mengikat beberapa streptavidin, avidin atau Neutravidin dan meningkatkan sensitivitas deteksi protein. Ada banyak reagen biotinilasi yang tersedia yang mengeksploitasi berbagai metode pelabelan.21 Interaksi yang sangat spesifik protein pengikat biotin dengan biotin membuat sistem ini menjadi alat yang berguna dalam sistem uji yang dirancang untuk mendeteksi dan menjadi target analit biologis.22

Aplikasi avidin-biotin dalam berbagai metode laboratorium.
Sistem avidin-biotin dapat digunakan untuk berbagai metode laboratorium. Interaksi spesifik avidin biotin membuatnya menjadi alat yang berguna dalam merancang sistem deteksi nonradioaktif dengan sensitivitas yang sangat baik.22 Metode yang paling umum menggunakan avidin atau streptavidin untuk mendeteksi probe terbiotinilasi. Beberapa metode laboratorium utama secara efektif menggunakan sistem ini antara lain imunohistokimia, pemurnian protein, diteksi protein dan diteksi asam nukleat.22
Afinitas tinggi dari avidin yang mengikat biotin menjadi reagen standar untuk berbagai skema diteksi imunohistokimia dan imunobloting. Dalam bentuk yang sederhana, metode tersebut memerlukan penerapan probe terbiotinilasi pada sampel dan kemudian mendeteksi probe yang terikat dengan suatu avidin atau streptavidin berlabel. Biotin yang paling sering terkonjugasi dengan antibodi primer atau sekunder, dan tag biotin kemudian dideteksi dengan protein pengikat biotin yang terkonjugasi dengan enzim, fluorophore atau molekul reporter lainnya. Banyak protein, seperti antibodi, dapat diberi label dengan beberapa tag biotin, masing-masing dapat terikat dengan protein pengikat biotin. Situs pengikatan beberapa biotin dalam molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.21 Pengoptimalan rasio biotin-to-probe dapat meningkatkan output sinyal dari sistem deteksi sehingga memungkinkan untuk membuat tes yang sangat sensitif. Teknik-teknik ini umumnya digunakan untuk melokalisasi antigen dalam sel dan jaringan dan untuk mendeteksi biomolekul dalam immunoassays dan teknik hibridisasi DNA.23
Deteksi Protein adalah metode dasar laboratorium yang digunakan untuk memantau pemurnian, produksi, tingkat ekspresi protein. Karena sebagian besar protein tidak mudah dibedakan dari protein lain dalam sampel yang kompleks, probe-target khusus digunakan untuk memfasilitasi deteksi tidak langsung protein tertentu. Dengan menggunakan sistem avidin-biotin, antibodi primer atau sekunder terbiotinilasi dapat dideteksi dengan protein pengikat biotin yang terkonjugasi reagen deteksi fluorescent atau enzimatik. Tes umum menggunakan format ini termasuk Western blotting dan ELISA24.
Western blotting dan ELISA mempunyai prosedur umum mendeteksi protein target yang diimobilisasi insitu atau invitro. Dalam setiap uji, protein target yang diimobilisasi oleh fiksasi, terserap atau ditangkap di permukaan dan kemudian diperiksa dengan antibodi terbiotinilasi. Tag biotin pada antibodi kemudian digunakan untuk melokalisasi protein pengikat biotin yang akan berkonjugasi dengan reagen deteksi.24

Contoh aplikasi klinis diteksi protein untuk diagnostik adalah diagnosis Refluks laringo faring (RLF) dengan menentukan ada tidaknya pepsin pada laring dengan metode immunoasssay (ELISA). Karena pepsin tidak disintesis oleh sel tipe apapun dalam saluran napas, maka adanya pepsin pada saluran napas merupakan bukti nyata bahwa pepsin tersebut berasal dari refluks isi lambung ke laringofaring, sehingga pengukuran pepsin pada sekret saluran napas dapat menjadi petanda diagnostik yang sensitif pada RLF. Adanya pepsin menunjukkan bahwa terdapat refluks asam lambung ke saluran napas atas karena pepsin tidak dihasilkan oleh sel manapun di tubuh kecuali oleh sel parietal lambung.25

Deteksi asam nukleat adalah metode laboratorium lain yang digunakan untuk menentukan keberadaan, jumlah atau urutan perubahan polinukliotida tertentu. Saat ini banyak laboratorium telah beralih ke bentuk-bentuk diteksi yang lebih cepat, seperti real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), Northern dan Southern blotting. Meskipun tidak secepat metode PCR, teknik ini juga perperan bagi hibridisasi in situ untuk koloni bakteri dan plak bakteriofag saat melakukan large cloning screens. Untuk metode ini, sebuah fragmen sasaran nukleotida ditransfer dan diimobilisasi ke membran blotting. Urutan target kemudian hibridisasi dengan probe nukleotida komplementer terbiotinilasi. Tag biotin kemudian dapat dilokalisasi dan dideteksi menggunakan protein pengikat biotin yang terkonjugasi dengan reagen deteksi. Contoh lain adalah Fluoresensi hibridisasi in situ terdeteksi oleh penguatan sinyal tyramide. Penyebaran Kromosom dibuat dari kultur cell line fibroblast MRC-5 dan dihibridisasi dengan probe α-satelit terbiotinilasi khusus untuk kromosom 17.26
Avidin digunakan dalam aplikasi pemurnian protein. Setelah biotin melekat pada molekul, tag biotin dapat digunakan untuk memfasilitasi pemurnian afinitas molekul yang menggunakan protein pengikat biotin yang terimobilisasi. Atau, molekul terbiotinilasi dapat terimobilisasi melalui interaksi dengan protein pengikat biotin.21 Kekuatan interaksi mengikat antara biotin dan avidin merupakan faktor yang membatasi kegunaannya. Hal ini dikarenakan diperlukannya kondisi khusus untuk melepaskan ikatan avidin-biotin (yaitu, untuk memisahkan dan elusi), dan ini dapat mengubah sifat protein sasaran. Untuk mengatasi keterbatasan ini, dirancang versi modifikasi dari resin avidin dan bentuk modifikasi dari reagen label biotin yang tersedia secara komersial yang membuat interaksi mudah reversibel. Ini termasuk avidin monomer, reagen disulfida biotin cleavable, dan iminobiotin dan desthiobiotin derivatif.21 Cara modifikasi avidin adalah dengan membuat karakteristik mengikat reversibel melalui nitrasi atau iodinasi dari situs pengikatan tirosin. Avidin yang dimodifikasi menunjukkan karakterisitik pengikatan biotin yang kuat pada pH 4 dan peningkatan pelepasan biotin pada pH 10 atau lebih tinggi. Avidin monomer dibuat oleh perlakuan avidin asli terimobilisasi dengan urea atau guanidin HCl (6-8 M), hal ini memberikan disosiasi lebih rendah KD ≈ 10-7M. Hal ini memungkinkan elusi dari matriks avidin terjadi di bawah kondisi denaturasi atau denaturasi ringan, menggunakan konsentrasi rendah biotin atau kondisi pH rendah.27,28

Aplikasi avidin-biotin dalam Radio Imuno Terapi (RIT).
Walaupun masih dalam tahap pengembangan, namun RIT merupakan terapi tambahan yang cukup menjanjikan untuk keganasan. Modalitas RIT saat ini baru terbatas digunakan sebagai terapi tambahan pada pasien dengan keganasan payudara dan limfoma non Hodgkin. Penggunaan RIT pada tumor padat masih menemui banyak kesulitan karena penangkapan RIT di tumor masih sangat rendah dan toksisitas radiasi pada jaringan normal yang radiosensitif, terutama sumsum tulang, sehingga membatasi dosis yang diberikan sehingga dapat mengurangi keberhasilan RIT. Beberapa teknik telah digunakan untuk meningkatkan penangkapan RIT dan mengatasi toksisitas. Teknik tersebut adalah teknik pretarget.29
Teknik pretarget merupakan metode yang bertujuan untuk meningkatkan penangkapan antibodi berlabel radioisotop oleh tumor dan mengurangi toksisitas pada sumsum tulang. Dari hasil penelitian preklinis maupun klinis menunjukkan bahwa teknik pretarget dapat memberikan dosis serap radiasi tumor lebih tinggi dibandingkan dengan RIT tanpa teknik pretarget. Walaupun dosis radiasi terhadap sumsum tulang berkurang, namun dosis radiasi pada ginjal relatif tinggi. Glomerulosklerosis berat dan gagal ginjal dapat terjadi setelah beberapa bulan pemberian terapi dengan teknik pretarget.30
Salah satu metode pada teknik pretarget berdasarkan dari interaksi (strept)avidin dan biotin. Metode ini berdasarkan interaksi yang sangat kuat antara avidin dan biotin. Nilai afinitas dari avidin-biotin adalah 1 juta kali lebih kuat dibandingkan dengan interaksi antigen-antibodi. Langkah pertama teknik Pretarget dilakukan dengan menyuntikan antibodi monoklonal terbiotinilasi. Antibodi monoklonal terbiotinilasi tersebut akan terakumulasi pada tumor. Langkah kedua dilanjutkan dengan penyuntikan avidin. Avidin akan berikatan dengan biotin pada antibodi monoklonal yang melekat pada tumor (lihat gambar 7). Langkah ketiga adalah menyuntikkan biotin berlabel radioisotop. Biotin berlabel radioisotop ini akan berikatan dengan kompleks avidin biotin antibodi monoklonal yang terakumulasi pada tumor. Dengan demikian dosis serap radiasi tumor menjadi lebih tinggi. 30

Aplikasi avidin-biotin dalam teknologi pertanian.
Avidin dapat dijadikan pestisida. Avidin mengikat biotin, dengan afinitas yang sangat tinggi, padahal biotin adalah koenzim yang diperlukan untuk semua bentuk kehidupan, sehingga pada banyak serangga yang mengalami defisiensi biotin karena memakan avidin, ditemukan pertumbuhan terhambat dan kematian. Avidin merupakan racun bagi tujuh spesies stored-product beetles (Coleoptera) dan ngengat (Lepidoptera). Avidin juga beracun bagi lalat (Musca domestica) dan lalat buah zaitun (Dacus oleae). Ketika avidin rekayasa secara genetik dalam jagung transgenik pada tingkat ≥ 100 ppm, avidin merupakan racun bagi perkembangan serangga dan mencegah kerusakan biji-bijian selama penyimpanan.31
Avidin yang diekspresikan dalam tembakau dan apel transgenik memberikan tingkat resistensi serangga yang tinggi terhadap ngengat umbi kentang, Phthorimaea operculella dan ngengat Epiphyas postvittana. Karena mempunyai spektrum yang lebih luas dari aktivitas insektisida, dan fakta bahwa avidin yang ada dalam diet manusia ternyata dosisnya beberapa kali lebih tinggi daripada dosis avidin yang menunjukkan aktivitas insektisida pada tanaman transgenik, dapat diharapkan bahwa avidin yang diekspresikan pada tanaman transgenik akan diproduksi secara komersial dalam waktu dekat. Bahkan, avidin sudah diproduksi di jagung transgenik, tapi hanya untuk ekstraksi sebagai reagen biokimia.32
Gen avidin buatan juga telah ditransfer ke tanaman padi. Melalui rekayasa genetika, Avidin diekpresikan dalam bulir beras transgenik tetapi tidak di daun. Konsentrasi avidin dalam gabah adalah sekitar 1.800 ppm. Semua larva kumbang bingung tepung (Tribolium confusum) dan Angoumois, ngengat biji-bijian (Sitotroga cerealella) mati ketika makan bubuk beras transgenik avidin, sedangkan sebagian besar serangga uji berkembang menjadi dewasa ketika mereka diberi makan diet kontrol beras nontransgenik. Avidin yang diekstrak dari beras transgenik kehilangan sebagian aktivitas pengikat biotin setelah 5 menit pemanasan pada suhu 95 derajat Celcius.33

Potensi avidin sebagai antiploriferasi
Penelitian mengenai pengobatan dan pengendalian dari kanker masih menjadi tantangan yang berat bagi kesehatan masyarakat dan belum terpecahkan hingga kini. Strategi dalam pengobatan penyakit kanker telah banyak dikembangkan dan salah satunya ialah dengan menggunakan agen kemoterapi. Banyak di antara pengobatan tumor dilakukan dengan cara mengintervensi pembentukan basa nukleotida purin atau pirimidin.34
Jalur sintesis purin de novo melibatkan sepuluh reaksi enzimatik yang mengkatalisis pengubahan dari 5-fosforibosil-1-pirofosfat menjadi inosin monofosfat (IMP). Prekursor dari nukleotida purin ini sangat diperlukan untuk sel normal, serta proliferasi sel tumor. Sel tumor memerlukan sejumlah besar asam nukleat dan lebih mengandalkan pada jalur sintesis purin de novo sedangkan sel normal lebih mengutamakan pemanfaatan jalur salvage dari nukleotida yang didaur ulang. Oleh karena itu, jalur sintesis purin de novo telah ditandai sebagai target yang layak untuk intervensi antineoplastik.35
Pada jalur sintesis purin de novo, terdapat dua buah reaksi transfer satu atom karbon, yaitu reaksi yang dikatalisis oleh glisinamida ribonukleotida (GAR) transformilase dan 5-aminoimidazol-4-karboksamida ribotida (AICAR) transformilase, dimana sebagai sumber donor penggal karbon tersebut berasal dari N10-formil tetrahidrofolat. Terdapat pula salah satu tahapan yang penting dalam sintesis purin de novo, yaitu tahap penambahan gugus karboksil (tahap 6). Gugus karboksil tersebut dapat berasal dari bikarbonat yang pada umumnya terdapat dalam larutan maupun karbondioksida metabolit. Dalam tahap reaksi pemindahan gugus karboksil tersebut, diduga terdapat peranan dari biotin, sebagai koenzim dari enzim AIR karboksilase.19 Hal ini membuat efek penambahan avidin terhadap jalur sintesis purin de novo menjadi pendekatan yang menarik untuk diteliti. Apakah avidin dapat mengikat biotin sehingga enzim yang terlibat dalam reaksi pemindahan gugus karboksil menjadi inaktif dan sintesis purin sebagai bahan baku asam nukleat menjadi terhambat?
Penghambatan sintesis purin yang secara tidak langsung mengarah pada penghambatan sintesis DNA, berkaitan erat dengan siklus sel. Siklus sel merupakan regulator yang penting dari suatu proses proliferasi sel dan pertumbuhan maupun pembelahan sel setelah terjadi kerusakan DNA.19 Secara umum, pembelahan sel terbagi menjadi 2 tahap, yaitu mitosis (M) (pembelahan 1 sel menjadi 2 sel) dan interfase (proses di antara 2 mitosis). Interfase terdiri dari fase gap 1 (G1), sintesis DNA (S), gap 2 (G2). Berdasarkan pengamatan terhadap siklus sel, dengan cara flowcytometri maka dapat diketahui lebih lanjut keterkaitan antara avidin dengan penghambatan proliferasi sel tersebut.33 Saat ini, Penelitian mengenai efek avidin sebagai antiproliferasi sel sedang dilakukan di Bagian Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia dan penelitian tersebut memperlihatkan bahwa avidin memiliki efek antiproliferasi sel.

Penutup.
Interaksi avidin/streptavidin merupakan interaksi biologis nonkovalen terkuat (Kd 10-15M1) yang diketahui di antara protein dan ligan. Karakteristik ini yang membuat streptavidin-biotin ideal sebagai suatu sistem penghubung yang umum dalam berbagai aplikasi bioteknologi misalnya digunakan dalam teknik berbagai pemeriksaan laboratorium, pengobatan, dan teknologi pertanian. Pemahaman mengenai karakterisitik avidin dapat digunakan untuk pengembangan pengobatan kanker melalui penelitian potensi avidin sebagai antiproliferasi sel.
Penggalian sifat avidin yang mengikat biotin adalah salah satu contoh bahwa pemahaman mengenai dasar dasar ilmu biomedik dapat digunakan untuk menghasilkan bioteknologi yang berguna bagi kehidupan manusia. Masih banyak kemungkinan aplikasi bioteknologi yang dapat dihasilkan dengan pemahaman ilmu biomedik. Ilmu biomedik menyediakan begitu banyak jawaban dari persoalan dalam kehidupan manusia. Semoga makalah ini dapat memotivasi kita untuk memperdalam pemahaman dasar dasar ilmu biomedik sehingga dapat digunakan untuk mengembangkan bioteknologi di indonesia.

DAFTAR PUSTAKA

1. Kresge N, Simoni RD, Hill RL. The discovery of avidin by Esmond E. Snell. J Biol Chem.2004. 279 (41): e5.
2. Rothemund DL, Thomas TM, Rylatt DB. Purification of the basic protein avidin using gradiflow technology. Protein Expr Purif. 2002 Oct;26(1):149-52.
3. Rosano C, Arosio P, Bolognesi M. The X-ray three-dimensional structure of avidin. Biomol Eng. 1999 Dec 31;16(1-4):5-12.
4. Gitlin G, Bayer EA, and Wilchek M. Studies on the biotin-binding site of avidin. Lysine residues involved in the active site. Biochem J. 1987 Mar 15; 242(3): 923–926.
5. Durance T D. Residual avidin activity in cooked egg white assayed with improved sensitivity. Journal of Food Science. 1991. 56 (3): 707–9
6. Hiller Y, Bayer EA, Wilchek M. Studies on the biotin-binding site of avidin Minimized fragments that bind biotin. Biochem. J. (1991) 278, 573-585

7. Green NM. Avidin. Advances in Protein Chemistry .1975. Volume 29. pp. 85–133.
8. Elo HA, Korpela J. The occurrence and production of avidin: a new conception of the high-affinity biotin-binding protein. Comp Biochem Physiol B. 1984;78(1):15-20.
9. Bubb MO, Green F, Conradie JD, Tchernyshev B, Bayer EA, Wilchek M. Natural antibodies to avidin in human serum. Immunol Lett. 1993 Mar;35(3):277-80.
10. Hood EE, Witcher DR, Maddock S, Meyer T, Baszczynski C, Bailey M, Flynn P, et all. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification. 1997. Molecular Breeding 3: 291–306
11. Fairhead M. Plug-and-Play Pairing via Defined Divalent Streptavidins. J Mol Biol. 2013. 426 (1): 199–214.
12. Määttä JA, Helppolainen SH, Hytönen VP, Johnson MS, Kulomaa MS, Airenne TT, Nordlund HR.Structural and functional characteristics of xenavidin, the first frog avidin from Xenopus tropicalis. BMC Struct Biol. 2009 Sep 29;9:63.
13. Taskinen B, Zmurko J, Ojanen M, Kukkurainen S, Parthiban M, Määttä JA. Zebavidin, an avidin-like protein from zebrafish. PLoS One. 2013 Oct 24;8(10):e77207
14. Fairhead M. Plug-and-Play Pairing via Defined Divalent Streptavidins. J Mol Biol. 2013. 426 (1): 199–214.
15. Almonte L, Lopez EE, Baro AM. Surface-charge differentiation of streptavidin and avidin by atomic force microscopy-force spectroscopy. Chemphyschem.2005;15:2768-2773.

16. Tarigan S, Sumarningsih. Produksi dan purifikasi streptavidin dengan aktivitas pengikatan biotin yang lebih tinggi.JITV.2014 Sept;19 (3) :231-8
17. Blitz JP, Gun VM. Surface Chemistry in Biomedical and Environmental Science. 5thed.Dordrecth:Springer;2005.
18. Bowman BA, Russell RM. Biotin. Present Knowledge in Nutrition, 9th ed, Vol 1. Washington, DC: International Life Sciences Institute.2006.
19. Nelson DL, Cox MM. Lehninger principles of biochemistry. 5thed. New york:WH Freeman and Company;2008.p.633-4.
20. Barat B, Wu AM. Metabolic biotinylation of recombinant antibody by biotin ligase retained in the endoplasmic reticulum. Biomolecular Engineering. 2007; 24 (3): 283–91.
21. Wilchek M, Bayer EA. The avidin-biotin complex in bioanalytical applications. Analytical Biochemistry,1988 may 28: 1–32
22. Beckett D,Kovaleva E, Schatz, PJ. A minimal peptide substrate in biotin holoenzyme synthetase-catalyzed biotinylation. Protein Science.2008;8 (4): 921–9.
23. Diamandis EP, Christopoulos TK. The biotin-strept(avidin) system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry, Vol 37, No 5, 1991.
24. Kendall C, Matiu II, Dreesman GR. Utilization of the biotin/avidin system to amplify the sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Journal of Immunological Methods.1983;56,( 3):329–39
25. Ali ME. Laryngopharyngeal reflux: diagnosis and treatment of controversial disease. Curr Opinion Allergy Clin Immunol 2008; 8(1):28-33.
26. Reddy CA, Beveridge TJ, Breznak JA, Marzluf G. Methods for general and molecular microbiology. 3rded.Washington DC:ASM;2007
27. Nordlund HR, Hytönen VP, Hörhä J, Määttä JA, White DJ, Halling K, Porkka EJ, Slotte JP, Laitinen OH, Kulomaa MS. Tetravalent single-chain avidin: from subunits to protein domains via circularly permuted avidins. Biochem J. 2005 Dec 15;392(Pt 3):485-91.
28. Holmberg A, Blomstergren A, Nord O, Lukacs M, Lundeberg J, Uhlén M. The biotin-streptavidin interaction can be reversibly broken using water at elevated temperatures. Electrophoresis. 2005;26 (3): 501–10.
29. Sharkey RM, Karacay H, and Cardillo TM. Improving the Delivery of Radionuclides for Imaging and Therapy of Cancer Using Pretargeting Methods. Clin Cancer Res 2005;11:7109-21.
30. Boerman OC, Koppe MJ, Posterna EJ, Corstens FH, Oyen WJ. Radionuclide therapy of cancer with radiolabled antibodies. Anticancer Agents Med Chem.2007;7:335-43
31. Kramer KJ, Morgan TD, Throne JE, Dowell FE, Bailey M, Howard JA. Transgenic avidin maize is resistant to storage insect pests. Nat Biotechnol. 2000 Jun;18(6):670-4.
32. Burgess EP, Malone LA, Christeller JT, Lester MT, Murray C, Philip BA, Phung MM, Tregidga EL. Avidin expressed in transgenic tobacco leaves confers resistance to two noctuid pests, Helicoverpa armigera and Spodoptera litura. Transgenic Res. 2002 Apr;11(2):185-98.
33. Yoza K, Imamura T, Kramer KJ, Morgan TD, Nakamura S, Akiyama K, Kawasaki S, Takaiwa F, Ohtsubo K. Avidin expressed in transgenic rice confers resistance to the stored-product insect pests Tribolium confusum and Sitotroga cerealella. Biosci Biotechnol Biochem. 2005 May;69(5):966-71.
34. Weaver FR. Molecular biology.5thed.New york:Mc Graw-Hill;2008.p.704-5
35. Schwartz GK , Shah MA. Targeting the Cell Cycle: A New Approach to Cancer Therapy. J Clin Oncol.2005;23:9408-21.